Pertemuan kembali Miles Morales dengan Gwen Stacy membawanya masuk lebih jauh ke multisemesta. Di sana ia mengenal Spider Society, kelompok Spider-People yang berupaya melindungi keberadaan semesta-semesta tersebut. Perselisihan tentang cara menghadapi ancaman membuat Miles berseberangan dengan para pahlawan lain. Ia harus menentukan jalan untuk melindungi orang-orang yang ia sayangi, meski pilihan itu tidak mendapat persetujuan bersama. Across the Spider-Verse melanjutkan perjalanan Miles dari film sebelumnya, sehingga hubungan yang sudah terbangun dapat menjadi bekal menonton. Titik awal ceritanya adalah pertentangan antara aturan kelompok dan tanggung jawab yang dirasakan seorang tokoh. Pertentangan dengan kelompok yang mengaku melindungi semesta membuat tugas kepahlawanan tidak sesederhana mengikuti aturan bersama. Miles harus menghadapi perbedaan antara jalan yang diharapkan orang lain dan tanggung jawab yang ia rasakan terhadap orang terdekat.